Πρωτεϊνες και Βιοϋλικα

Η επιφανειακή προσρόφηση των πρωτεϊνών που λαμβάνει χώρα κατά την εισαγωγή ενός βιοϋλικού στον οργανισμό

Της Ειρήνης Χαϊνογλου

Τι είναι τα Βιοϋλικά;

Ως βιοϋλικό ορίζουμε κάθε υλικό , φυσικό ή τεχνητό, που τοποθετείται, μόνιμα ή προσωρινά, σε επαφή με το πολύπλοκο περιβάλλον των ιστών του ανθρώπινου σώματος με σκοπό την αποκατάσταση της δομικής ακεραιότητας και της λειτουργίας των ιστών. Η ραγδαία ανάπτυξη τους οφείλεται στο γεγονός ότι στοχεύουν στη διασφάλιση της υγείας και της ποιότητας ζωής του ασθενή. Σε παγκόσμιο επίπεδο δαπανώνται 10 δις/ρια ευρώ για αγορά ορθοπεδικών βιοϋλικών ετησίως με ετήσιο ρυθμό αύξησης των πωλήσεων 13%. Οι ΗΠΑ ελέγχουν το 52% της παγκόσμιας αγοράς βιοϋλικών και η Ευρώπη το 25%. Επιπρόσθετα, τα βιοϋλικά συνδέονται με την αλματώδη τεχνολογική εξέλιξη και την έντονη ερευνητική δραστηριότητα στην επιστήμη των υλικών, στη μοριακή βιολογία, στη βιοπληροφορική, στη ρομποτική κ.α. Η σχεδίαση και η κατασκευή των σύγχρονων βιοϋλικών είναι το αποτέλεσμα αρμονικής διεπιστημονικής συνεργασίας και συνδυάζει την επιστήμη των υλικών με τις βιοϊατρικές επιστήμες. Τα τεχνητά βιοϋλικά μπορούν να κατασκευαστούν από κράματα, κεραμικά, σύνθετα υλικά και πολυμερή. Τα βιοϋλικά 1ης γενιάς είχαν ως στόχο την αντικατάσταση, τα βιοϋλικά της 2ης γενιάς είχαν ως στόχο την αποκατάσταση ενώ τα βιοϋλικά της 3ης γενιάς έχουν στόχο την αναγέννηση. Συγκεκριμένα, διαθέτουν βιοαπορροφησιμότητα, λειτουργούν σε μοριακό επίπεδο (νανοκλίμακα), καθοδηγούν τα κύτταρα προς την επιθυμητή απόκριση και προσφέρουν εξωσωματική και in vivo ιστική μηχανική. Η βιοσυμβατότητα ενός βιοϋλικού εξαρτάται από πολλούς παράγοντες (π.χ ποιότητα και είδος υλικού, βιολογικό περιβάλλον). Ένας βασικός παράγοντας, από τον οποίο εξαρτάται η αποτελεσματικότητα του ενός βιοϋλικού είναι η επιφανειακή προσρόφηση πρωτεϊνών η οποία λαμβάνει χώρα μετά την εισαγωγή του βιοϋλικού στον οργανισμό. (http://www.chemeng.ntua.gr/files/bioylika_yfantis_internet.pdf).

Τι είναι οι πρωτεΐνες;

Οι πρωτεΐνες είναι τα πιο πολυδύναμα μακρομόρια στους ζώντες οργανισμούς και εξυπηρετούν βασικές λειτουργίες σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες. Λειτουργούν ως καταλύτες, μεταφορείς και αποθηκευτές άλλων μορίων, όπως το οξυγόνο, παρέχουν μηχανική στήριξη και ανοσοπροστασία, διαβιβάζουν νευρικές ώσεις, δημιουργούν κίνηση και ρυθμίζουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση.

exsaΕικόνα 1. Στάδια αναδίπλωσης μίας πρωτεϊνης στο χώρο

Οι πρωτεΐνες είναι γραμμικά πολυμερή δομούμενα από μονομερή αμινοξέων. Η λειτουργία τους εξαρτάται άμεσα από την τρισδιάστατη δομή τους. Επομένως, οι πρωτεΐνες αντιπροσωπεύουν τη μετάβαση από τον μονοδιάστατο κόσμο των αλληλουχιών στον τρισδιάστατο κόσμο των μορίων που παρουσιάζουν εύρος λειτουργιών. Επιπλέον, περιέχουν μία μεγάλη σειρά λειτουργικών ομάδων και μπορούν να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους και με άλλα βιολογικά μακρομόρια, για να δημιουργήσουν πολύπλοκα συσσωματώματα. Μέσα στα  συσσωματώματα αυτά μπορούν να δράσουν συνεργειακά και να εμφανίσουν ιδιότητες που δεν προϋπήρχαν στα ανεξάρτητα μακρομόρια.

exgta

Εικόνα 2. Γενικός τύπος αμινοξέων

Τα αμινοξέα είναι οργανικά οξέα με μια τουλάχιστον αμινομάδα. Αποτελούνται από μια καρβοξυλική ομάδα και μια αμινομάδα, οι οποίες είναι συνδεδεμένες στο ίδιο άτομο άνθρακα καθώς και από μια πλευρική ομάδα R. Τα αμινοξέα συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας πεπτιδικό δεσμό  και με αυτόν τον τρόπο οι αμινομάδες και οι καρβοξυλομάδες στις πρωτεΐνες εξουδετερώνονται (με εξαίρεση τα δύο αμινοξέα που βρίσκονται στα άκρα). Για αυτό το λόγο έχουν ιδιαίτερη σημασία η φύση και οι ιδιότητες των ομάδων R των αμινοξέων. Ανάλογα, λοιπόν, με το αν τα αμινοξέα έχουν πολικές ή μη πολικές ομάδες R, κατατάσσονται σε υδρόφιλα ή υδρόφοβα αντίστοιχα. Εν συνεχεία, τα πολικά κατατάσσονται σε ουδέτερα, όξινα και αλκαλικά, ανάλογα με το εάν και πως ιονίζονται σε pH 6-7. Όσων πολικών αμινοξέων οι ομάδες R δεν ιονίζονται σε pH 6-7, καθώς βέβαια και όλα τα υδρόφοβα αμινοξέα, από οξεοβασικής σκοπιάς είναι ουδέτερα. Όλες αυτές οι ιδιότητες που αποκτούν οι πρωτεΐνες, λόγω των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων που τα αποτελούν, παίζουν χαρακτηριστικό ρόλο στην αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών με τις επιφάνειες των βιοϋλικών και στην προσρόφηση τους ή όχι από αυτές. (Berg et al.).

Προσρόφηση πρωτεϊνών σε βιουλικά

Το μεγαλύτερο πρόβλημα στην κατανόηση και περιγραφή του φαινομένου της πρωτεϊνικής προσρόφησης είναι η έλλειψη κατάλληλων τεχνικών που να επιτρέπουν την παρατήρησή της σε πραγματικό χρόνο,  καθώς και την παρατήρηση της προσρόφησης παραπάνω από μίας πρωτεΐνης στην ίδια επιφάνεια. Άλλο ένα πρόβλημα είναι η μεγάλη ποικιλία των παραγόντων που επηρεάζουν την προσρόφηση των πρωτεϊνών και που διαφέρουν ανάλογα με τη φύση της επιφάνειας. Άλλη μία παράμετρος πολύ σημαντική για την αποτελεσματικότητα ενός βιοϋλικού είναι οι αντιβακτηριδιακές του ιδιότητες. Μικρός αριθμός βακτηρίων από το δέρμα του ασθενούς ή από τα χέρια του προσωπικού ή από το περιβάλλον του νοσοκομείου για παράδειγμα, είναι πιθανό να μολύνουν το βιοϋλικό κατά τη χειρουργική επέμβαση για την εισαγωγή ενός εμφυτεύματος.  Καθώς τα βακτήρια προσκολλώνται γρήγορα στις επιφάνειες,  αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και να σχηματίζουν βακτηριακά συσσωματώματα πάνω σε μία επιφάνεια, τα οποία περιβάλλονται από εξωκυτταρική ουσία (slime). Αυτή η συσσωρευμένη βιομάζα των βακτηρίων μαζί με την περιβάλλουσα εξωκυτταρική ουσία είναι γνωστή ως biofilm.  Μετά το σχηματισμό του biofilm,  κάποια θυγατρικά κύτταρα (βακτήρια)  φεύγουν από την εξωκυτταρική περιβάλλουσα ουσία (slime) είτε σταματώντας την παραγωγή της ή συνεχίζοντάς την,  και είναι ελεύθερα να μετοικήσουν σε νέες περιοχές της επιφάνειας και να επαναλάβουν τη διαδικασία που περιγράφηκε.

exkv

Εικόνα 3

Καρδιακός βηματοδότης:Βιοϋλικό το οποίο χρησιμοποιείται στην καρδιά. Είναι μια συσκευή που παράγει ηλεκτρικά ερεθίσματα, τα οποία διεγείρουν την καρδιά μέσω ενός ή δυο ειδικών καλωδίων.

Η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών με επιφάνειες υλικών είναι ένα δυναμικό φαινόμενο που χαρακτηρίζεται από πολυπλοκότητα (χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών, χαρακτηριστικά των υλικών). Με την είσοδο ενός υλικού στους ιστούς λαμβάνεται ταχύτατα (κατά κανόνα εντός δευτερολέπτων έως λεπτών) χώρα προσρόφηση πρωτεϊνικών μορίων επί αυτού προς σχηματισμό επιφανειακού στρώματος. Η ταχύτητα με την οποία εξελίσσεται το φαινόμενο οφείλεται αφενός στην παρουσία πρωτεϊνών σε υψηλές συγκεντρώσεις στο ρευστό μικροπεριβάλλον όλων των ιστών (πλάσμα, λέμφος, μεσοκυττάριο υγρό), αφετέρου δε στην ικανότητα των πρωτεϊνικών μορίων να διαχέονται ταχύτατα προς την εκτιθέμενη επιφάνεια και να εναποτίθεται σε αυτή. Στο σημείο αυτό αξίζει να αναφερθεί ότι κατά τελείως αντίστοιχο τρόπο και οι επιφάνειες των κυττάρων εμφανίζονται καλυμμένες με πρωτεΐνες ή σύνθετα μόρια πρωτεϊνικής εν μέρει φύσεως (γλυκοπρωτεῒνες, λιποπρωτεῒνες). Στην περίπτωση των κυττάρων οι πρωτεΐνες αυτές παράγονται κατά τεκμήριο από το ίδιο το κύτταρο και διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο για την κίνηση του, την ικανότητα του να «αισθάνεται» το περιβάλλον του και να ανταλλάσει ουσίες με αυτό. Ως και την ικανότητα του να συνδέεται με τα γειτονικά του κύτταρα προς σχηματισμό δομικός άρτιων και λειτουργικών ιστών. Η σύσταση των κυτταρικών πρωτεϊνών και η διάταξη τους στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης είναι συγκεκριμένη, γενετικώς καθορισμένη και αποτελεί βασικό παράγοντα για την ικανότητα του οργανισμού να αναγνωρίζει τα κύτταρα ως «δικά του», ώστε να μην στρέφει τους αμυντικούς του μηχανισμούς εναντίον αυτών. Η «γυμνή» από πρωτεΐνες επιφάνεια ενός βιοϋλικού κατά τη στιγμή της εισαγωγής του στον οργανισμό παριστά μια «ξένη» επιφάνεια, συνεπώς πολλοί ερευνητές θεωρούν ότι η ταχεία κάλυψη της από πρωτεϊνικά και άλλα βιομόρια είναι ένα τελεολογικώς χρήσιμο φαινόμενο, καθ΄ότι με τον τρόπο αυτό η επιφάνεια του υλικού «αδρανοποιείται» (ουσιαστικά «κρύβεται» κάτω από ένα πρικάλυμμα φυσιολογικών πρωτεϊνών και επομένως αντιμετωπίζεται λιγότερο επιθετικά από τον οργανισμό. Ορισμένοι μάλιστα διατυπώνουν την άποψη ότι οι δυσμενείς αντιδράσεις έναντι των εμφυτευμάτων βιοϋλικών προέρχονται από το γεγονός ότι το πρωτεϊνικό επίστρωμα αυτών σχηματίζεται κατά τρόπο τυχαίο και μη οργανωμένο, με αποτέλεσμα να διαφέρει από το επιφανειακό πρωτεϊνικό «προφίλ» των φυσιολογικών κυττάρων και τελικά να απορρίπτεται. Με βάση την αντίληψη αυτή έχουν γίνει προσπάθειες σύνθεσης βιοϋλικών με προκαθορισμένη επιφανειακή πρωτεϊνική σύσταση, μέσω επιλεκτικής πρόσδεσης πρωτεϊνών στην επιφάνεια τους. Τα πειράματα αυτά στηρίζονται συνήθως στη χρήση αυτοοργανούμενων μονοστρωμάτων (Self-Assembled Monolayers, SAMs) λιποειδικής σύστασης.

Σε κάθε περίπτωση, η προσρόφηση των πρωτεϊνικών μορίων στην επιφάνεια των βιοϋλικών εξελίσσεται σε τρία διαδοχικά στάδια (De Jongh HH et al ,Kidoaki S, Martsuda T ,Heitz F, Van Mau N ,Nakanishi K et al): Καταρχήν συμβαίνει διάχυση των πρωτεϊνικών μορίων προς την επιφάνεια, ακολουθεί η καθ΄ εαυτού προσρόφηση τους στην επιφάνεια. Τελικά επισυμβαίνει αναδιάταξη των πρωτεϊνικών μορίων και/ή εκ νέου εκρόφηση τους από την επιφάνεια σε ένα τρίτο στάδιο που ενδεχομένως διαρκεί από κάποιες ώρες έως και αρκετές ημέρες μετά την αρχική εισαγωγή του βιοϋλικού στον οργανισμό. Οι μεταβολές διαμόρφωσης των πρωτεϊνών που επισυμβαίνουν στο στάδιο αυτό αφορούν προσανατολισμό χημικών ομάδων προς την επιφάνεια του υλικού κατά τρόπο ώστε να μεγιστοποιούνται οι υδρόφοβες, ηλεκτροστατικές κ.ο.κ. ελκτικές αλληλεπιδράσεις των προσροφουμένων μορίων με αυτή. Κατά κανόνα ο πρωτεϊνικός σκελετός «απλώνει» καθώς υδρόφοβες πλάγιες ομάδες μετατοπίζονται από το κέντρο του μορίου και αναπροσανατολίζει ώστε να ευρίσκονται σε επαφή με την εκτόπιση μορίων ύδατος από την επιφάνεια του βιοϋλικού οδηγούν συνολικά σε αύξηση της εντροπίας του συστήματος προσροφημένης πρωτεΐνης- βιοϋλικού και επομένως σε σταθερότερη προσρόφηση (η οποία μπορεί να φτάσει ακόμη και μέχρι του σημείου της μη αντιστρεπτής προσρόφησης). Παράλληλα οι δομικές μεταβολές έχουν αντίκτυπο και στα βιολογικά χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης με εμφάνιση νέων αντιγονικών επιτόπων ή κατάργηση/απόκρυψη ήδη υπαρχόντων, καθώς και με μεταβολή της βιολογικής δραστικότητας του πρωτεϊνικού μορίου (σχηματισμός νέων ενεργών κέντρων ή μεταβολή της διαμόρφωσης των ήδη υφισταμένων). Χαρακτηριστικό παράδειγμα πρωτεΐνης που υφίσταται σημαντικές μεταβολές διαμόρφωσης κατά την προσρόφηση της σε διεπιφάνειες στερεού- υγρού είναι το ινωδογόνο. Για τις μεταβολές αυτού γίνεται εκτενέστερα λόγος σε επόμενη παράγραφο.

Είναι σημαντικό να αναφερθεί στο σημείο αυτό ότι όλα τα ρευστά βιολογικά υλικά περιλαμβάνουν όχι μόνο μια αλλά αρκετές διαφορετικές πρωτεΐνες. Κατά συνεπεία η διαδικασία της προσρόφησης πρωτεϊνικών μορίων ανταγωνίζονται το ένα το άλλο για κατάληψη όσο το δυνατόν μεγαλύτερου ποσοστού της επιφάνειας του υλικού. Το γεγονός αυτό δημιουργεί δυσκολίες στη μελέτη της αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών – βιοϋλικών, δεδομένου ότι οι περισσότερες από τις μελέτες αυτές αφορούν διαλύματα ενός τύπου πρωτεΐνης (single protein solutions). Προκειμένου να πραγματοποιηθούν μελέτες με σύνθετα διαλύματα πολλών πρωτεϊνών ή απευθείας με βιολογικά υγρά είναι απαραίτητο κάθε μια από τις περιεχόμενες σε αυτά πρωτεΐνες να σημανθεί με κάποιον τρόπο, ώστε να είναι δυνατόν να διακριθεί από τις υπόλοιπες. Η σήμανση γίνεται συνήθως με πρόσδεση στο μόριο κάποιου χρωμοφόρου ή ραδιενεργού «δείκτη» (Kawakami H et al ,Higuchi A et al.). Είναι προφανές ότι η κατεργασία του πρωτεϊνικού διαλύματος προκειμένου να επιτευχθεί αυτού του είδους η σήμανση  είναι πολύπλοκη και δαπανηρή, με αποτέλεσμα να αυξάνονται σημαντικά οι απαιτήσεις της εκάστοτε μελέτης σε χρόνο και κόστος. Παράλληλα πρέπει να επισημανθεί ότι η σήμανση μεταβάλλει τη δομή της μελετούμενης πρωτεΐνης, γεγονός που μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στη συμπεριφορά της κατά της προσρόφηση, με συνέπεια τα αποτελέσματα της αντίστοιχης μελέτης να μην αντικατοπτρίζουν την πραγματικότητα και άρα να μην είναι αξιόπιστα. Σημαντικές πάντως πληροφορίες για την συμπεριφορά συστημάτων πρωτεϊνών σε σχέση με επιφάνειες στερεών προσέφερε το ερευνητικό έργο του Leo Vroman στις αρχές της δεκαετίας του ’90 (Seung – Yong J et al). Ο  Vroman διατύπωσε την άποψη ότι προσρόφηση πρωτεϊνών από μεικτά διαλύματα σε επιφάνειες εξελίσσεται δυναμικά με συνεχή μεταβολή της σύστασης του πρωτεϊνικού στρώματος που εναποτίθεται στην επιφάνεια. Έτσι, σε ένα αρχικό στάδιο προσροφούνται πρωτεΐνες οι οποίες λόγω της υψηλής συγκέντρωσης και του μικρού μεγέθους είναι σε θέση να διαχέονται ταχύτερα και σε μεγαλύτερες ποσότητες προς την επιφάνεια. Τέτοια πρωτεΐνη είναι λ.χ. στην περίπτωση του αίματος η λευκωματίνη. Στη συνέχεια οι πρωτεΐνες αυτές εκτοπίζονται από την επιφάνεια από άλλες οι οποίες εμφανίζουν μεγαλύτερη συγγένεια προς το υλικό και επομένως είναι σε θέση να προσροφούνται σταθερότερα σε αυτό, πλην όμως λόγω του μεγάλου μεγέθους και/ή της χαμηλής συγκέντρωσης τους στο πρωτεϊνικό διάλυμα διαχέονται προς την επιφάνεια με βραδύτερο ρυθμό. Προκειμένου για το αίμα τέτοιες πρωτεΐνες είναι το ινωδογόνο (το οποίο εκτοπίζει την λευκωματίνη από τις επιφάνειες όπου αυτή έχει προσροφηθεί), καθώς και άλλες πρωτεΐνες μικρότερης συγκέντρωσης όπως το κινινογόνο υψηλού μοριακού βάρους (High Molecular Weight Kininigen, HMWK) και ο παράγοντας von Willenbrand, που προσροφούνται αρκετά καθυστερημένα αλλά έχουν την ικανότητα να προσροφούνται σταθερότερα και να εκτοπίζουν τόσο την λευκωματίνη όσο και το ινωδογόνο.

Από τα παραπάνω καθίσταται φανερό ότι η διαδικασία προσρόφησης   των πρωτεϊνών σε μια διεπιφάνεια στερεού υγρού είναι μια πολυσύνθετη διαδικασία στην οποία υπεισέρχονται εκτός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης παράγοντες όπως η χημική συγγένεια πρωτεΐνης- επιφάνειας, η υδροφοβικότητα ή υδροφιλικότητα της επιφάνειας, το ηλεκτρικό φορτίο αυτής, ο χρόνος αλληλεπίδρασης κ.α. Η πολυπαραγοντικότητα του φαινομένου της πρωτεϊνικής προσρόφησης σημαίνει ότι μελέτες που αφορούν μονοπρωτεϊνικά διαλύματα και αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες αλληλεπίδρασης, αποτελούν αναγκαστικά μια προσεγγιστική θεώρηση και είναι δυνατόν να απέχουν σημαντικά από την τελικά in vivo συμπεριφορά της εκάστοτε επιφάνειας.

exprot

Εικόνα 4

Στο σχήμα φαίνεται η προσέγγιση ενός μορίου πρωτεΐνης σε μια επιφάνεια. Η πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με μόρια νερού ανιόντα και κατιόντα τα οποία βρίσκονται στον περιβάλλοντα χώρο. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές  των μορίων και της επιφάνειας του βιοϋλικού είναι που θα καθορίσουν αν τελικά θα προσροφηθεί η πρωτεΐνη στην επιφάνεια ή όχι.

exxe

Εικόνα 5.

Απεικόνιση της διαδικασίας χειρουργικής επέμβασης για την αποκατάσταση του χόνδρου. Μια μικρή τομή αφήνει εκτεθειμένο το σημείο φθοράς του χόνδρου (εικόνα επάνω αριστερά) και οι ειδικοί αφαιρούν τον νεκρό ιστό από τις άκρες του τραύματος (εικόνα επάνω δεξιά). Στη συνέχεια εφαρμόζεται η ειδική κόλλα στη βάση και στα τοιχώματα γύρω από το προβληματικό σημείο αφού έχει προηγηθεί η εφαρμογή της τεχνικής μικροκαταγμάτων (εικόνα Β). Εγχέεται το διάλυμα υδρογέλης (βιοϋλικό) στο σημείο (εικόνα C). H αιμορραγία που προκαλείται από τις οπές της τεχνικής μικροκαταγμάτων «παγιδεύεται» μέσα και γύρω από την υδρογέλη (εικόνα D). Πηγή: Science Translational Medicine/AAAS.

Συντάκτης:
Χαϊνογλου Ειρήνη
Βιοχημικός- Βιοτεχνολόγος
Μεταπτυχιακό ειδίκευσης στις  Κλινικές Εφαρμογές Μοριακής Ιατρικής